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RAPD技能使用中的一些问题及对策


4、小结
  ①操作单倍体 操作胚乳中止RAPD分析,能够克制构建遗传图谱中这些困难。由于针叶树的胚乳是单倍体,记载了杂合的母本染色体组在减数分裂进程中的遗传事情,不存在杂合型,中止RAPD遗传分析时,与共显性符号具有相同的遗传行为,是天然的优质作图材料。现在已中止遗传图谱构建的有湿地松、欧洲赤松、火炬松、杨树、日本柳杉和桉树。可是由于缺少细胞遗传学的研究,暂时还不能断定连锁群和染色体之间的对应联系。国内尹佟明等操作马尾松的胚乳构建了分子图谱。这种研究所接收的作图材料不具备永久性质,作为处置赏罚赏罚办法之一是将所取的材料中止造就。转化为永久性集体,操作半同胞集体中止数量性状基因定位(Quantitative trait locus,QTL)研究。另一个办法是与集团别离法(Bulked segregant analysis ,BSA)相联合,经过与意图性状连锁的符号在单倍体集体中的别离,在图谱上中止基因定位或找出与意图性状相连锁的其它符号。
  异源双链问题 Ayliffe研究亚麻锈病菌时发现F1代中出现的一条带在亲本中没有出现,进一步研究发现这一条带是由2个等位基因组成的异源双链形成的,这2个等位基因除中心刺进的38bp的序列外,其他序列相同。这种条带能够在晚辈中遗传,在该研究中这种条带约莫占0.16%。在蜜蜂的研究中也发现了类似的问题,这种条带能够用单链核酸酶将其吊销。也能够将电泳温度前进到60℃以上,使异源双链变性,以吊销其影响。
  2.4扩增条带的取舍 重复性问题 为了克制RAPD重复性差的问题,应设置重复测验。作为DNA多态性符号位点的条带是应该可重复的,重复性好是最重要的取舍目标,而带的强弱不应该作为取舍的目标。有学者以为带的强弱与其在基因组中的复制数有关。但据Thormann对十字花科植物分析,RAPD产品的强弱与该产品在基因组中的复制数无直接联系,而与引物及模板的同源性水平有关。分析一个位点时,要作片面分析,若某一单个的全部带均弱,其模板可能有问题(浓度、分子量);若某一单个的大部分带与其它单个强度共同,仅有一条或少数几条带弱,可能存在复制数不同。重复性欠好的弱带(无规律出现的带)可能由非专一性扩增、产品间退火或其它酬谢要素构成,不能记载。
  2.3污染问题 测验中应设空白对照,由于引物、各种缓冲液和双蒸水城市构成污染。而且Taq酶也可能出现污染,给分析带来困难,所以必需设置对照以扫除体系差错。而且,酶也尽可能优化。
  ③操作一套缺体一四体系或双端体系,以取得与主旨基因连锁的符号引物中止扩增反应,然后中止原位杂交,断定特异性带在染色体上的方位。
  ③在表征分析中另一个值得留神的问题是一些RAPD产品的出现存在相关联系,即一个位点与另一个位点相连锁。若将这个不同单独核算,适当于对某一性状极度加权。
  2.1 温度 RAPD一般反应条件是:变性92-95℃,常用94℃,30-60s;延伸72℃,60-120s;退火35-37℃,30-60s。变性和延伸温度一般没有太大革新,而退火温度影响较大。退火温度低,引物和模板联合特异性较差,出现的条带可能添加;退火温度高,引物和模板联合特异性增多。有人提出,在寻觅基因不同为主旨的测验中,退火接收33-34℃效果更好。在优化方案中,退火温度可能要前进,以便下降布景,得到少而清楚的"带"。温度的梯度率也长短常重要的,出格是退火与延伸之间的梯度尤为重要。各种仪器的控温、升降温功能均有不同,一些仪器(如一些旧类型的仪器)在抵达特定的温度前就开始计时,一些PCR仪显现的温度与实践温度会有不同。这些在想象脚步和效果分析时有需要考虑,所以注明所用仪器的消费厂家、品牌、标准,就显得很有需要,关于同一批测验,留神操控在相同的温度条件下中止反应,效果才有可比性。
  1.1原理RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA),即随机扩添加态性DNA技能,是由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年别离研究提出的,又称恣意引物PCR。它的使用是根据这样的一个推理:关于同一模板DNA,用同一引物扩增既可能得到相同的带谱(模板基因组间可能具有同源性),也可能得到差异的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子符号。事实上,差异基因组DNA总是必定差此外,所以用RAPD就能够中止分子符号研究。实践上讲,在必定的扩增条件下,扩增的条带数取决于基因组的杂乱性。对特定的引物,杂乱性越高的基因组所孕育发作的扩增条带数也越多。
摘要:总述了RAPD技能的一些实践性问题,包括RAPD与其它分子符号技能比较的利益,影响效果重复性的要素,显性符号孕育发作的原因,条带取舍的标准等。提出在测验中处置赏罚赏罚这些问题的一些办法:严格操控反应条件,接收单倍体和单剂量符号,体系学研究中要联合其它办法中止分析,定位基因时要选用适合的集体等。
(浙江大学蚕学系,杭州 310029)
  这些作业在一些基础研究较多的范畴或与人类联系较为密切的物种中中止较为敏捷,比如小麦、水稻找到的RAPD分子符号已有许多。但林木等多年生植物研究中止稍迟滞,要害是缺少适合的集体。
  RAPD技能是由多种身分干预的生化反应,反应中各种身分均为微量,只管其反应灵敏度高,可是影响要素较多,会出现重复性差等一些问题。为了得到较不变的效果,各种反应参数必需事前优化选择,操作中每一步都必需当心稳重,以避免出现不对。
  2.5电泳分辩率问题 电泳时,基因组差异方位的扩增产品共同移动的可能性是有的,即差异分子量的扩增产品可能在电泳时没有脱离而形成一条带,凝胶别离体系和基因组的亲缘联系有可能前进这种概率。一般来说,聚丙烯酰胺和银染的分辩效果比琼脂糖和溴化乙铵要高,用较长(可抵达20cm)或浓度更高(2%)的琼脂糖凝胶有助于前进分辩率。当然,跟着分辩率和灵敏度的前进,更可能出现测验差错。所以有人评述:最稳妥而简略的办法是用琼脂糖电脉别离而且只留神那些无疑而重发性高的带。可是,聚丙烯酰胺和银染所提示的高信息量的多态性无疑可加速分子符号的判定进程。
  ①由于引物的协作性等,基因组的RAPD位点有时不能全部检出,构成假象上的不同。根据这种情况,能够以为,RAPD能够使用于种间甚至近缘属之间联系的研究,但有必定的局限性。因差异种度的扩增产品难以作同源性分析,只能作表征分析,然后只能从类似性或遗传距离上去分析亲缘联系。其效果可能与真实的体系联系相左。

焦锋,楼程富

  每一种技能和办法都有其下风和缺点,只需仔细研究,在实践运用中留神取长补短,就会阐扬出其最大的效果,RAPD技能也是如此。对此中止的一系列研究会使RAPD技能日益老练和完善,并在人类知道天然生命现象中阐扬更大的效果。
  在找到适合的分子符号后,既可直接用于辅佐选择育种(Molecule-marker assisted selection,MAS),也可经过对特异片段的别离和两头测序将之转换为序列标识表记标帜位点(Sequence-tagged sites,STS)。从这个分子符号动身找到主旨基因需经过几个程序:A、用稀有切点内切酶将基因组DNA切成大片断DNA;B、用脉冲电泳别离大片断DNA;C、将大片断DNA克隆到YAC(Yeast artificial chromosome)中,建造YAC文库;D、以显现多态性的扩增产品为探针从YAC文库中调出含有该RAPD符号和与其连锁的主旨基因的大片断DNA;E、以该RAPD符号为起点向主旨基因中止染色体滑步或跳动,以找到主旨基因。Michelmore首要操作这种办法找到了莴苣抗性基因的符号,Koller等操作这种办法找到与苹果疮痂病抗性基因有关的分子符号。
  ⑤RAPD和农艺性状的体系分析比较阐明,二者相差不大,没有出现相反的情况。而且RAPD比农艺性状供给了更多的遗传信息。
2 RAPD技能本身存在的问题及对策
  1.2 RPAD特色 与PCR比较,具有以下几个特色:①RAPD运用的是随机引物,不必要预先了解主旨的基因和相应的序列。②操作简洁,测验周期短,能在较短的时间选择很多样品。③引物具有广泛适就性,适用于自动化操作分析。

3、使用中存在的问题及策略

  ②将RAPD条带作为单剂量符号 单剂量符号(Single-dose RAPD markers)是从两物种和其杂交孕育发作F1代的分子符号被选择的。选择构建图谱用的符号有2个原则:A、它们必需在一个亲本中存在而在另一个亲本中不存在;B、它们在晚辈中必需以l:1别离。这种办法适当于一个杂合体和一个隐性纯合体的测交,称为双向假测交(Two-way pseudo-testcross)。在多倍体植物中,不论基因组是怎么组成的(异源多倍体或同源多倍体),也不论材料的多倍性程度怎么,单剂量的符号都适当于简略的等位基因(同源多倍体)或适当于二倍体基因座上的杂合等位基因(异源多倍体)。因此根据这些单剂量符号的连锁情况能够构建分子图谱。RAPD条带作为单剂量符号使那些基因组DNA含最大,代代周期长的乔木和多倍体植物的遗传图谱研究走出了几乎阻滞的情况。Grattapagalia操作这种策略首要构建了巨桉和尾叶桉的分子连锁图谱。Conner操作这种策略构建了3个苹果品种的分子图谱。Mudge操作甘蔗及杂交晚辈的RAPD条带作为单剂量符号中止连锁分析构建了甜根子草的51个连锁群,并分析了其染色体组的数目。虽然这些连锁图谱是单个特异性的,但能够为数量性状定位供给结构结构,为符号辅佐选择育种奠定基础。
  ①操作易位系、回复突变系、等位基因系、近交重组系等特别材料 从实践上讲,除主旨基因及附近区域外,其它部分彻底共同。假设检测出多态性,不同肯定在主旨基因及附近区中,也就是说RAPD符号在这个规模内与主旨基因连锁。可是要取得这些材料比较困难,例如等位基因系必要回交20代,时间太长。RAPD分析中一般用近等位基因系NILs(Near isogenic lines),回交6代以上即可。回交6代时,供体DNA的份额为l/128,用RAPD找到的与主旨基因连锁的符号与主旨基因在距离上还适当远。
  3.2体系学研究中的问题 体系学是RAPD研究最为敏捷的范畴,许多作物都用RAPD作过亲缘联系分析,大部分效果和形状分类效果相类似,仅有少数破例。可是近年来,有人对其效果的可靠性提出差异的观点,首要有以下几点:
  3.4纯度和外源基因查验问题 虽然由于RAPD条带的灵敏和重复性等问题,纯度查验研究还只停留在测验阶段。但已有的对大麦、玉米、大豆、棉花、小麦、水稻的测验表达,RAPD技能是判定品种的有用办法。信任其在纯度查验和专利护卫方面会取得较为广泛的使用。
1 RAPD技能原理及特色

  ④在体系发育学分析中,由于RAPD条带具有显性的遗传特征,多态性信息量较低。假设其符合二歧分枝树的假定,就能够对革新的性状予以加权,并中止分析。可是许多植物的核基因组是有性的二倍体,而且它们的进化前史是网状分枝树,未便于分析。一般以为叶绿体、线粒体和有些细菌及真菌的病原体符合二歧分枝树的假定。但由于其基因组较小,没有重组,它们的信息量只适当于核基因组中具有多个等位基因的一个同工酶座位,这样预算的基因多样性值的标准差实践上会比有多个核基因蛋白座位得出的大。其非编码区在一些动物类群中的进化速度很快,因此做种上程度研究时将会影响效果的精确性,但种下程度影响较小。
  ②因RAPD在种间或属间的变异程度很高,取样代表性是一个较大的问题,即操作某一单个代表一个种或用一个种代表一个属都可能构成效果的倾向。因此,最好能找到集体特异或种特异性的条带。
  2.6显性符号问题 RAPD符号来自于模板DNA的仿制,经过30一40次循环,扩增条带数量实践上可达2。原模板中扩增位点是纯合仍是杂合已无法判别,由于纯合位点的扩增条带只适当于杂合位点的2倍,电泳时无法检测到其不同。杂交中。假设亲本一方为纯合体,F1代就能够全部表明出该条带;如为杂合体,该条带在F1中应为l:l别离,即一半晚辈有该条带,而另一半则没有。当然来自于多复制区的条带分析更为杂乱。
  同一条带的同源性问题 Thormann将RAPD产品符号作探针,杂交效果表达,与探针片断迁移率共同的带有时并差异源,这种情况仅发作在种间。并比较了RFLP和RAPD符号在种内和种间得出的效果,发现RFLP和RAPD符号在种内程度的效果彻底符合,但在种以上等级的效果相差甚远,这阐明在电泳效果的同一个带中,有可能存在序列差异但分子量相同的几条带,RAPD无法检测。这种可能在种内较少发作,而这种间可能性较大,Castagna用RFLP和RAPD比较研究也得出了相同的定论。

  非孟德尔遗传的条带 Heun等分析以为,在显现多态性的非迷糊条带中有92.5%的表明为孟德尔显性遗传,其他的条带不符合孟德尔遗传,分析以为可能由差异的序列组成。一般测验中大多接收符合孟德尔遗传的条带中止分析。在连锁图谱分析中,基因型错误能够部分吊销,即在F1代或1:1混合物中没有出现的条带,在其父母本中应尽可能去掉。
  总归,用RAPD作体系分析应联合其它办法,效果才更有说服力。

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  与RFLP比较,具有以下特色:①RAPD分析只必要少数模板,一次扩增仅需20-100ng,这关于DNA量很少的材料中止基因组分析有利。比如对花粉粒、原生质体、种子等的DNA分析是真实可行的。②RAPD符号具有更大的随机性,亦有利于图谱的构建。关于DNA含量大的和多倍体物种,RFLP探针会与多倍体的多个片段杂交,所得到的混合指纹会对其它等位基因的分析带来困难。而且由于DNA量较大,中止单复制的Southern杂交不很实践,至少必要很长的暴光时间,而且已知的探针数量有限。RAPD大大增多了可构建遗传图谱物种的数量。③无需借助于有伤害性的同位素,消耗的人力物力少。④灵敏度高。引物中的单个碱基的革新会引起扩增条带和强度的剧烈革新,这是RFLP所无法比较的。⑤RAPD符号能够笼罩整个基因组,包括编码和非编码区,能够反映整个基因组的革新。⑥RAPD产品有大于50%的条带扩增于单复制区,经过克隆和序列分析后,可作为RFLP和原位杂交的探针,在基因定位、克隆及辅佐选择育种中能够广泛使用。
  90年代前期RAPD技能得到广泛的使用,几乎一切的作物都有这方面的研究呈文。但跟着研究的深入,人们发现该技能存在必定的缺点,并对此作了一些探索。本文仅就RAPD技能的原理和使用中存在的实践性问题及一些改善门径的研究作一总述。
  3.3符号、定位主旨基因 符号、定位主旨基因是相对较为缓慢的一个范畴,这是由于RAPD符号勘探的是整个基因组的革新,包括编码区和非编码区,要和基因位点联络起来有必定的困难。一般的变异集体性状的革新涉及到基因组内较大的规模(微效多基因),RAPD不成能全部检出。而且RAPD检出的多态性又不必定是性状变异的标识表记标帜(可能扩增于非编码区)。另一困难是RAPD扩增的特异性片段有些为重复序列,转化为RFLP探针有必定困难。据Grattapaglia用48个RAPD片段所作的杂交测验表达,有53%来自于低复制区(<10),20.4%来自于10~100复制区,18.4%来自于100一1000复制区,8.2%来自于高度重复区(>1000)。这只需经过选择出与单复制区连锁的符号予以处置赏罚赏罚。假设RAPD符号和基因位点或性状不能联络起来,其实用价值就会大大下降。为此人们作了以下探索。
  ②集团别离法(BSA)对不存在上述特别生物模型的集体,可接收这种办法。即操作F2别离集体为材料,根据主旨基因的表型把F2集体分为2群(例如抗病的和不抗的),每一群中将各单个DNA等量混合,这样形成2个DNA混合池。在每个基因池中,岂论集体性状怎么,在主旨基因的表型上都是共同的,2个集体之间,主旨基因的表型都是相反的。因此,在2个集体之间彻底差异、在每个集体之内各单个间又是彻底相同的RAPD扩增产品即能够为是与主旨基因连锁的RAPD符号。这种办法适当于把分析材料作为近等位基因系。
  2.2反应物的影响 PCR扩增受多种身分的制约,产品仅在部分循环中呈指数式(2)增加,逐步将抵达一个渠道期,模板是要害制约要素之一,RAPD产品取决于此,测验中非常精确的模板浓度长短常要害的一个程序。浓度过低,分子磕碰机率低,偶然性大,扩增产品不不变;浓度过高,会增多非专一性扩增产品。更重要的是,若循环数操控欠好,引物过早消耗完,后边循环中,PCR扩增产品的3端会和原模板及每一次循环的扩增产品退火,构成不等长度的延伸。因此,假设原模板浓度过高,非专一性扩增产品就足以形成布景,这是高浓度模板构成弥散型产品的原因。相对而言,模板纯度影响不大,即反应液中蛋白质、多糖、RNA等大分子物质影响不大。志向的模板和引物浓度能孕育发作多态性丰盛、强弱带清楚的RAPD图谱。引物3端的重要性好像更大。其他,Mg+2浓度也影响反应的参数包括产品的特异性和引物二聚体的形成,人们在各自的测验中得出差异的定论,约莫在1.5-4mmol/L规模内。总归,各种反应物的浓度应事前中止选择优化。
  3.1遗传图谱构建的问题 RAPD是一种显性符号,符合孟德尔遗传规律,不能区别杂合型和纯合型,因此在遗传分析及遗传图谱的构建等一些方面遭到约束。现在,在理论中,首要操作了以下2种办法。
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